20하나6.전사체 분석을 위한 RNA-seq 방법 좋네요

RNA-Seq methods for transcriptome analysis. Hrdlickovaetal. 2016​ 요약디프의 염기 기술은 최근 몇년 동안 생물학과 의학을 혁신하는 높은 처리량 방식으로 핵산 서열에 대한 우리의 이해를 위한 단 1염기의 수준의 정확성을 제공합니다. RNA또는 RNA-Seq의 염기는 지금, 유전자 발현을 분석하고 세로프게 RNA종을 밝혀1조 같은 방법임. RNA의 발발과 물질대사 측면은 cDNA library preparation을 위한 특별한 방법으로 조사될 수 있습니다. 이 연구에서는 isoform detection, gene fusion detection, digital gene expression profiling, targeted sequencing, single-cell analysis및 여러 특정 응용 분야의 1조 같은 분석을 위한 현재 RNA-Seq방법을 실험합니다. 또한 세포내 RNA를 조사하는 방법, 기존 RNA-Seq 방법의 기술적 과제 및 향후 방향을 실험하는 접근방법에 대해 논의합니다.서론 RNA 분자는 모든 살아있는 세포의 필수 구성 요소이다. 특정 조건에서 부여된 세포에서 각 RNA 분자의 동정과 abundance를 이해하는 것이 RNA 연구의 궁극적인 목표이다. 우리가 RNA에 대해 알고 있는 것 중 대부분은 소수의 특정 분자가 분석되는 생화학적 방법을 사용하는 연구에서 비롯된 것이다. 1990년대 초에 대규모 RNA배열의 조사를 가능하게 높은 처리량 접근이 등장하는 슴니다. Adamsetal. 에 의해 개발된 서열태그(EST; expressed sequence tag)법은 상보적 DNA(cDNA) 복제를 부분적으로 서열화하여 유전자 발현을 조사하여 해당 RNA의 서열과 존재량을 밝혀냅니다. EST데이터는 1990년대 유모도우에서 세로프게 유전자를 확인하는 데 중심적 역할을 핬 슴니다. 그리고 이 와인은 가격이 비싸고, 반 정량적이라는 단점이 있습니다. 유전자발현의 연속분석(SAGE; Serial Analysis of Gene Exprssion) 기법은 Velculescuetal.에 의해 개발되었습니다. cDNA당 짧은 태그 영역( 짧은 SAGE방법의 경우 15 bp나 긴 SAGE방법의 경우 21 bp만 서열화함으로써 유전 자당 발현한 분석 비용을 대폭 줄있 슴니다. 참 제 1990년대 중반, 유전자 발현 분석을 위한 EST및 SAGE의 방법은 대규모 연구를 하지 않을 때 더욱 경제성이 좋은 DNA microarray기술의 등장으로 대체되 옷슴니다. 유전자발현에 대한 DNA microarray 분석은 프린팅기법이 과도한 insitusynthesis에 의해 고체표면에 부착된 탐침자(probe)로 전사체에서 유래한 형광표지의 혼성화(hybridzation)시키는 것에 기초합니다.이 방법으로 유모드 전반의 전사물을 알아볼 수는 있지만 선행서열 정보 또는 레퍼런스유 모드/전사체가 Microarray probe의 설계에 이용 가능하다는 요구는 발견된 기술로 이 기술의 개발과 적용을 제한했습니다. 또 cross-hybridization(교차 혼성화)와 배경의 신호는 종종 1부의 유전자에 대한 특이성이 낫고과 민감도가 낮은 슴니다.21세기의 한개 10년은 deep sequencing또는 차세대 염기 서열 분석 법(NGS;Next-Generation Sequencing)으로도 알려진 massive parallel sequencing이라는 책에서 대용량의 염기 서열 분석 법, 대규모 병렬 염기 서열 분석 법으로 번역하겠습니다. 짧은 시간에 전례 없는 양의 데이터를 수집할 수 있는 능력으로 생물학 및 의학 분야에서 혁명적인 반응을 보였고, deepsequencing은 신속하게 RNA 연구를 바꿨습니다. 현재 RNA-Seq는 유전자 발현을 연구하고 새로운 RNA종을 확인하기 위한 가장 좋은 방법이다. DNA microarray 기반 방법에 비해 RNA-Seq는 background noise가 적고 검출을 위한 dynamicrange가 넓습니다. 가장 중요한 것은 RNA-Seq가 알려지지 않은 유전자와 새로운 동형(isform) 전사물 분석에 중요한 서열 동정을 직접적으로 밝히는 것. RNA-Seq에 대한 다양한 기술이 개발되었습니다. 이쵸크소 RNA-Seq의 1조 같은 측면과 특정 문재를 연구하기 위한 RNA-Seq의 응용을 실험합니다. 우리는 RNA-Seq실험에서 2가지 중요한 관념 사인인 이 방법으로 편향(bias)과 민감성(sensitivity)에 관한 과제와 해결 방안을 논의합니다. 또 우리는 RNA의 발발과 물질 대사의 측면을 조사 전문적인 방법을 논의합니다. ​ RNA-seq의 1조 같은 측면 RNA분자를 직접 식오은 새 것이 가능하지만, 대부분의 RNA-Seq실험은 DNA기반의 염기를 위해서 고안된 장비의 발달로 DNA서열 분석기에서 열립니다. 그래서 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 제조하는 것은 RNA-Seq의 필수 단계이다. RNA-seq 라이브러리의 각 cDNA는 특정 플랫폼에서의 증폭 및 시퀀싱에 필요한 어댑터 서열(adapter sequences)에 따라 특정 크기의 cDNA insert로 구성됩니다. cDNA 라이브러리의 준비방법은 조사중인 RNA종에 따라 다르고 사이즈, 순서, 구조적 특징, abundance 등이 다를 수 있습니다. 주요 고려 사항은(1)그와은심 있는 RNA분자를 포획하는 방법(2)RNA을 정의한 크기의 second-strand cDNA로 변환하는 방법(3)증폭의 염기를 위한 cDNA예측단에 아답터 서열(adapter sequences)을 배치하는 길임. 이에 대해서는 모두 sound섹션에서 설명하겠습니다. ​ Poly(A)+저는 사물(transcripts)선택 아마도 포리아데닐화된 RNA의 염기는 RNA-Seq의 가장 보편적인 방법 1. 진핵 생물의 경우 mRNA및 lncRNA(>200nt)은 poly(A)의 꼬리를 가지고 있슴니다. poly (A) 꼬리는 total RNA로부터 poly (A) 꼬리+RNA를 많이 발현시킨 적도록 기술적 편의를 제공했으며 이는 pool의 1~5%를 차지하고 있슴니다. oligo-dT로 코팅된 자성 비드와 셀룰로오스 비드를 사용하여 poly(A)+RNA를 선택합니다. 역전사(RT) 하도록 포리아데닐화된 RNA는 oligo-dT프라이머를 사용할 수도 있슴니다, oligo-dT프라이밍 기반 방법은 전 사물의 3'부분이 많아지고 3'편향이 있어서, poly(A)을 선택하는 과정과 역전 사법 시험은 과정을 함께 하는 슴니다. 또 oligo-dT는 A가 전 사물 순서 속에 많은 경우 internal poly(A)priming의 편향이 1어 있으세요. 그래서 RNA의 양이 적지 않은 이상 poly(A)+RNA를 선택하는데 poly(A) 알약을 하는 것이 좋다(다sound 참조). rRNA 제거 원핵생물의 mRNA와 같은 Non-polyadenylated RNA, FFPE(formalin-fixed, paraffin-embedded) 검체와 같은 mRNA 단편 및 진핵세포의 poly(A)-전사물이 조사대상이 됩니다. 이러한 RNA를 서열 분석할 때 가장 중요한 문재는 세포에서 RNA가 가장 풍부하지만 대부분의 연구에는 조금도 관념이 없는 rRNA를 제거하는 방법이다. RNA pool에서 RNA를 제거하기 위한 몇 가지 어프로치가 개발되었습니다. rRNA를 제거하는 하나의 방법은 rRNA로 혼성화(hybridization)될 가능성이 있는 sequence-specific probe를 사용하는 것이다. 원치 않는 rRNA와 cDNA를 바이오틴화된 DNA와 혼성화하는 sound 스트렙타비딘 비드로 제거합니다. rRNA에 antisence(역배열) DNAoligo 처리하여 표적화되어 RNase H에 의해 분해되고 제거됩니다. PDD(probe-directed degradation)로 알려진 방법이다. 이 접근법은 혼성시키는 것보다 쉽지 않지만 rRNA와 다른 종에 맞게 설계된 고유 probeset을 계속 적용해야 합니다. 최근에 비연속 서열(noncontinous sequence)기반의 방법이 개발되고, 이들의 문재 중 1부를 다루옷슴니다. 이 방법에서는 rRNA 및 다른 RNA의 cDNA를 포함하는 total cDNA가 원형화되어 rRNA probe로 혼성화 대해줍니다. 혼성된 서열은 Duplex-specific nuclease(DSN)로 분해되어 증폭되지 않습니다. 따라서 이 접근법은 대량의 토탈 RNA를 필요로 하며 임상 샘플을 취급할 때 어려울 수 있습니다. rRNA 제거를 위한 다른 접근법은 역전사(RT)시키는 동안 특정 RNA 분자에 결합하여 rRNA를 제거하는 not-so – random(NSR) primer를 사용합니다. NuGEN사가 Ovation RNA-Seq라는 이름으로 상품화한 이 방법은 rRNA가 없는 hexamer(6랴은치에)나 heptamer(7랴은치에)primer를 사용합니다. 이 접근법과 거의 똑같이 한 연구에서는 44개 heptamer를 사용하고 rRNA과 고도로 발현된 전사 부분을 제거하는 슴니다. 최근 연구에서는 다른 연구에서 그대로 사용되는 700개의 NSR primer대신 역전사에만 40개의 primer를 사용하는 슴니다. 이 어프로치의 주된 이점은 NSR primer가 부분적으로 분해된 RNA 및 적은 양의 시료에서도 잘 작동한다는 것. 따라서 다른 sequence targeting 방법과 마찬가지로 이 접근법은 종에 따라 다르고 의도하지 않은 부분이 프라이밍되는 문재가 과도하게 나타납니다. 그럼에도 불구하고 원핵생물로 NSR primer는 poly(A)를 정제할 때 많이 사용됩니다.​ 위에 언급된 sequence기반 접근 방식 외에도 1부 방법은 rRNA의 특정 기능을 이용하고 이를 제거합니다. C0T-혼성화 방법은 열변성, re-annealing및 DSN에 의한 선택적 분해에 기반합니다. abundant 시퀀싱에서 유래한 second-strand cDNA는 보다 적은 양의 cDNA에 비해 annealing 속도가 빠르기 때문에 우선적으로 분해됩니다. 선택적 분해는 예상단 효소 5'-인산 의존성 핵산 예상단 가수 분해 효소(엑소 뉴 클리 아제)(TEX)을 사용하여 수행되고 있으며 rRNA나 tRNA와 마찬가지로 5'-monophosphate와 RNA분자를 인식합니다. 요컨대 염기서열 분석에 필요한 RNA 전사물을 풍부하게 하는 방법을 선택하는 것은 실험의 목적과 많은 기술적 요소에 달려 있습니다. 몇 가지 연구는 제거와 프라이밍에 기초한 방법에 의한 rRNA 제거에 대한 프로토콜을 비교하였습니다. 진핵세포의 경우 사용편리성과 상대적으로 낮은 비용 때문에 poly(A)+RNA의 oligo-dT bead 기반의 정제가 대부분 응용분야에서 사용됩니다. 참 제 1반 적으로 적은 양의 샘플의 경우 oligo-dT프라이밍이 더 나는 결과를 제공합니다. 두 poly(A) 선택방법은 인트론 서열오염을 효율적으로 처리할 수 있습니다. RNA샘플이 부분적으로 붕헤도에고 나의 사용자가 비봉욕 RNA(non coding RNA)에 그와은심이 있는 경우, PDD또는 NSR-주사에 의한 rRNA제거가 1반 적에게 필요합니다. NSD-프라이밍은 주로 소량의 RNA 시료에 사용되는 반면 PDD는 대량의 시료에 대해 더 잘 작동합니다.단편화(Fragmentation) RNA는 Poly(A) 선택 또는 rRNA 제거 후 역전사 되기 전에 특정 크기로 단편화됩니다. 대부분의 현재의 염기 플랫폼이 읽을 수 있는 크기의 한계가 있기 때문에(Illumina sequencer의 판독의 길이는 600 bp미만)단편화 과정이 필요합니다. RNA는 알칼리성 용액, Mg2+, Zn2+과 같은 2가 양이온을 가진 용액, RNase III 같은 효소 등에서 단편화할 수 있는 슴니다. ​ 알칼리 용액 또는 2가 양이온을 이용한 단편화는 전형적으로 70℃ 같은 고온에서 실행되고 당표은 화성시 RNA구조의 영향을 완화시킵니다. 그럼에도 불구하고 화학적 단편화에 의한 RNA의 단편화는 완전히 무작위는 아닙니다. 마찬가지로 RNase III 기반의 방법은 효소가 이중사슬 RNA 서열을 선호하므로 편향된 결과를 가져올 수 있습니다. 그래서 RNA의 불 1규정한 단편이 편향의 원천이 될 수 있으며, RNA의 특정 영역을 구분하지 않도록 합니다. 대안으로 intact RNA는 역전사 될 수 있으며 full-lengthc DNA는 단편화할 수 있습니다. cDNA를 단편화하는 전통적인 방법은 Acoustic shearing(sound용 전단 및 초sound파 처리)의 사용이 필요하며 이는 RNA의 단편화보다 자동화에 더 부합하지 않습니다. 대안으로 full-length 이중사슬 cDNA는 DNase에 의해 단편화될 수 있습니다. transposon 기반의 이른바 tagmentation 방법을 이용한 최근의 발달로 cDNA를 단편화하고 동시에 어댑터 서열을 추가할 수 있게 되었습니다. 이 방법으로 Tn5 transposase는 2중 가닥 DNA의 단편화를 매개하고 빨리(~5분)씨 생각단의 아답터 들어 뉴클레오티드를 연결합니다. 참 제 Tn5와 다른 효소 기반 cDNA단편화 방법은 정확한 효소:DNA의 비율을 필요로 하여 RNA단편화보다 방법 최적화가 쉽지 않슴니다. 결과적으로 RNA의 단편화는 현재 여전히 RNA-Seqlibrary preparation에서 가장 빈번하게 사용되는 방법이다.어댑터(Adaptors)와 방향성(Directionality) 기본적인 RNA-seq 라이브러리 프로토콜을 보면 증폭과 시퀀싱이 되기 전에 원하는 크기의 cDNA가 random hexamer primer와 RNA 단편의 역전사로 발발되며 거인 모드 길이의 cDNA 단편이 DNA 어댑터에 연결되어 발발합니다. 간단하지만 이 접근법은 어떤 DNA의 사슬이 RNA의 sensestrand에 해당하는지에 관한 정보를 잃어버립니다. 스트럭처 특이성이 없으면 antisense 및 새로운 롭 RNA를 확인하기 어렵고 sence RNA의 부정확한 측정을 스토리할 수 있습니다. 그래서 cDNA 라이브러리에서 RNA의 방향성을 포착하기 위한 몇 가지 방법이 개발된 거죠.​ 하나번째 접근은 RNA분자의 5'와 3'예상단에 다른 어댑터를 직접 부착하는 것(그림 1(a). 원래 small RNA-Seq용으로 고안된 이 방법은 RNA단편에서 3'인산기를 제거하고 5'인산기를 처음 시작합니다. 이어 truncated RNA Ligase 2를 사용하는 5'아데닐화된 3'어댑터와 RNA Ligase I을 사용하는 5'어댑터의 순차적 결합이 이어집니다. ​ 5'및 3'어댑터의 사이의 서열의 차이에 의해서 RNA의 strandedness는 저장합니다. 실장이 단순하지만, 이 접근 방식은 5'및 3'예기단 서열 모드가 ligation단계에 영향을 줌으로써 상당한 편향을 줍니다. 그리고 이 문재는 각 어댑터의 ligation 예상단에서 Random nucleotide를 사용함으로써 크게 줄어들었습니다.​ 두번째 접근은 두번째 cDNA합성 과정에서 dUTP를 결합하는 것(그림 1(b). 표지(lebel)된 실은 dUTP 함유 DNA에서 우라실 염기를 절단하는 효소인 Uracil DNA glycosylase(UDG)로 PCR 증폭되기 전에 분해될 수 있습니다. 또한 U-함유사는 Phusion 중합효소 같은 내열성 중합제를 위한 poortemplate이므로 증폭되지 않습니다. 이와 같이 difined 어댑터 서열을 갖는 firstrandc DNA에서만 증폭되며 시퀀싱 판독에 방향정보를 부여합니다. 근 특이적 RNA-Seq에 대한 다른 프로토콜의 체계적인 비교는 dUTP 기반 방법이 sequence coverage의 균등성 면에서 가장 효과적임을 과인하였습니다. 실제로 이 방법은 상업 지향적인 RNA-Seqlibrary preparation protocol일 것.참 제 그것은 손이 많이 가서 물질 손실을 이야기할 수 있는 여분의 효소 처리 및 정제 단계가 필요하기 때문에 1반 적으로 적은 양의 시료에는 적합하지 않는 슴니다.RNA 조각에 어댑터를 추가하여 새로운 방법을 개발하려는 몇 가지 시도가 있었습니다. 이런 식의 한 포옹 와잉잉 Peregrine은 작은 태그가 포함된 random-hexamer에서 주사한 뒤 template switching방법을 사용합니다(그림 1 c). ​ 또 다른 방법인 BrAD-Seq(Breath Adapter Directional sequencing)은 tag sequence을 도입하였기 때문에,'breathing'으로 불리는 2중 가닥 DNA에서 1시적으로 방향 분리를 이용한다. 또 다른 방법인 BrAD-Seq(Breath Adapter Directional sequencing)은 'breathing'으로 불리는 방법을 사용하여 2중 가닥 DNA에서 1시적으로 방향을 분리하여 태그 서열을 도입하기. 세번째 예는 200 nt에 단편화된 small RNA을 보존하는 RNA에 태그를 순차적으로 연결하는 것. DSN을 매개로 한 정규화(normalization)단계는 rRNA를 제거하는 데 사용됩니다. 또 모든 RNA종으로 stranded RNA-Seq라이브러리에 대한 거의 동일한 프로토콜이 보고되고 있지만 역전사를 향해서 tag sequence를 포함 oligo가 RNA의 3'예상단에 연결합니다. 2번째 태그는 역전사 프라이머에 의해서 행해집니다. 여러 sound 첫 번째 방향합성에 이어 cDNA ligase를 통한 cDNA의 원형화(circularization)와 두 개의 태그를 사용한 라이브러리의 직접 증폭(directamplification)이 이루어집니다.​

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증폭(amplification) 및 분자표지(Molecular labels)의 대부분의 시퀀서 검출 한계에 따라 cDNA 라이브러리는 시퀀싱 전에 PCR에 의해 증폭 단계를 거쳐야 한다. PCR 동안 적은 증폭주기가 사용되지만 cDNA의 크기와 조성 변이는 불균일 증폭을 초래할 수 있습니다. 하나부는 기하급수적으로 증폭되고 하나부의 cDNA는 고원효과(plateaueffect)가 자신있습니다. PCR 증폭 편향을 보정하기 위해 시퀀싱 결과에서 PCR 복제 리드를 제거하는 방법이 도입되었습니다. 하나의 방법으로 random RNA 단편이라는 소가족 하에 동일한 시작 및 끝을 가지고 있는 최종 시퀀싱 read가 RNA duplicated read로 간주해 병합하는 것이다. 그러면 이 방법의 단점은 종종 생기는 단편으로 인해 단편화된 영역에서 자주 생기고, 자신은 read를 제거해야 한다는 것. 또 다른 방법은 PCR산물을 구별하기 위해 UMI(Unique Molecular Identifier)라고도 불리는 분자표지를 사용한다. 분자표지는 일방적으로 PCR 증폭되기 전에 어댑터 시퀀싱 내에 도입됩니다. 단지 한가지 세포에서 cDNA을 만들기 위한 수정된 프로토콜로, 분자의 표지는 증폭된 두번째 cDNA합성 과정에서 파편화되는 동안 Tn5 transposase에 의해서 도입되었습니다. 그러면 새로운 digital counting of targeted RNA와 같은 하나부 어플리케이션에서는 역전사되는 동안 분자표지가 처음이 됩니다. 분자표지의 크기(염기수)와 복잡성이 다릅니다. 원칙적으로 이들은 defined sequence 또는 random nucleotide를 포함한다. 최종 라이브러리에서 1개 잡아낸 분포 때문에 선택된 defined sequence은, 순서 선택 및 제조의 복잡성으로 기술적 어려움이 있습니다. 대조적으로 random sequences는 실장하기 쉽지만 분자 표지간에 높은 가변성을 공급한다. 분자표지는 RNA의 양이 적은 경우와 single-cell RNA-Seq(향후 참조)와 같이 시퀀싱에 많은 PCR 사이클이 필요한 상황에서 특히 유용하다.특정 목적을 위한 RNA-seq 방법 Genexpression profiling을 위한 태그(tag) 기반 방법 DGE-Seq:digital genexpression(DGE)-Seq(유전자 발현 프로퍼널링) 또는 Tag-Seq는 SAGE에서 유래한 딥시퀀싱 분석 방법이다.SAGE와 마찬가지로 이 방법은 폴리(A) 꼬리를 이용한 비드에 mRNA 부착, 비드 위의 first, secondstrandc DNA, 빈번한 절단제한 효소를 갖는 이중사슬 cDNA의 절단을 포함한다. 비드에 부착된 자신의 멀리 3'단편을 태그 지정 효소라고 하는 다른 제한 효소의 인식 부위와 함께 5'화단 어댑터에 연결한다. tagging효소는 cDNA을 끊고 짧은 21bp태그를 생성한 향후 3'이야기단의 두번째 어댑터에 연결한다. 그런 향후 cDNA를 PCR로 증폭한 향후 시퀀싱 한다. 짧은 태그만 모든 전사물로부터 시퀀싱되기 때문에 DGE-Seq는 부여된 sequencing depth에 대해 기존의 RNA-Seq보다 경제적이며, 같은 수의 read가 생성될 때 더 높은 동적 감지 범위를 공급할 수 있습니다. 설계상 DGE-Seq는 RNA strandedness를 저장한다. 이 방법은 여러 회사에서 상업화되고 있으며, 특히 simple gen expression profiling이 목적이지만, 때때로 유용하다. 완성된 유전체 또는 전사 단체 RNA-Seq read의 full alignment이 없을 때 선택하는 방법이기도 하다. ​ 3'end sequencing:나는 사물의 3'이야기단 부위에만 특이적으로 염기하기 위한 방법 많은 방법으로 전 사물의 3'이야기단의 부위를 특이적으로 염기다. 이러한 방법의 대부분은 처소음에는 모든 진핵생물에서 광범위한 현상인 상보적 절단 및 폴리아데닐 부위를 조사하기 위해 개발되었습니다. DGE-Seq와 마찬가지로 이 방법의 데이터를 이용해 유전자 발현을 조사할 수도 있습니다. 이런 식의 하나부는 PAS-Seq, poly(A)-Seq, 3'T-fill등과 함께 역전사 또는의 염기를 주사하기 위해서 oligo(dT)를 사용한다. 이 접근법의 한 가지 흥미거리는 내부 poly(A) 프라이밍에 의해 높은 빈도로 cDNA 단편을 생성할 수 있다는 것이다. 3P-Seq및 3'READS 같은 다른 방법은 RNA기반의 ligation을 사용하고 3'이야기들 단편들을 포획하다. 이러한 방법이 internal 프라이밍 사고를 성공적으로 해결하지만, RNA ligase의 시퀀싱 선호는 편향을 초래할 수 있습니다. 이 방법에 대한 보다 자세한 연구는 Ref 55에서 찾을 수 있죠. 역시 주목하는 것은 3'이야기들 영역과 폴리(A)의 꼬리의 길이를 동시에 검사할 수 있는 방법임. TAIL-Seq는 poly(A)의 후부의 3'이야기단에 어댑터를 처음 함께 poly(A)의 후부의 길이와 서열의 근처의 서열을 밝히려고 삽입물의 양의 이야기단의 염기를 수행한다. (paired-end sequencing)"​ 관련의 방법이다 PAT-Seq는 Klenow폴리메라아제를 사용하여 poly(A)의 후부의 3'이야기단에 아답터의 염기를 추가하고, single read의 염기를 사용하여 poly(A)부위뿐 아니라 poly(A)tail의 하나부 또는 전체 부위의 서열을 얻습니다.​ 본질적으로 DGE-Seq및 3'이야기단의 염기는 전사를 자기 손으로 만들려는 하 쟈싱의 단편을 사용하는 tag기반 접근이다. 유전자 발현 분석에 효과적이지만'shotgun'스타 1개의 RNA-Seq보다 높은 변이성을 가질 수 있습니다. 이곳에는 자신의 전사물이 여러 단편에서 자신이 나타납니다. 단편화, 어댑터 연결 및 PCR 편향에 따라 태그 기반 데이터를 batch 효과로 쉽게 적용할 수 있습니다.Alternatice solicing과Genefusion을 발견하기 위한 시큰싱어의 모든 multiexon 유전자는 선택적 이어맞추기(AS)에 자신이 있습니다. 선택적 이어맞추기(AS)는 세포과정 조절에 중요한 역할을 하며, 많은 인간 질병과 관련이 있습니다.하나부의 RNA-Seqread는 exon-exon junction을 포함하여 선택적 이어맞춤(AS)의 직접적인 증거가 됩니다. 역시 통계적 추론방법을 사용하여 선택적 정합(AS) 패턴을 예측하는데 internal exonic region에 mapping된 read를 사용할 수 있습니다. AS를 조사하는 것보다 직접적인 방법은 exon-exon junction 영역을 직접 시퀀싱하는 것이다. 특정 exon-exon junction 서열을 목적으로 하는 oligopair를 사용하여 Fulab은 특정 splice juction 영역의 분석을 공급하는 RASL-Seq를 개발하였습니다. 그러면, 신exon-exon junction 시퀀스의 사전 지식은 oligo 디자인에 필요하다.이어 맞추기와 마찬가지로 세포 융합 현상은 2개의 비연속적 유전체의 땅이 붙어 세포 융합이 한 입 하나로 되기도 합니다. 염색체의 재조합에 의해서 발생하는 세포 융합은 암의 약 20%를 차지한다. 융합현상은 특정 생물정보학 방법으로 RNA-Seq 데이터를 사용하여 즉시 감지할 수 있습니다. 융합 현상의 검출은 전형적으로 융합 접합부 또는 융합한 유전자의 5'와 3'이야기단 사이의 발현의 차이로 인해서 하나발죠크잉 RNA-Seq방법은 하나 발죠크에 융합 접합을 감지하기에 충분하지 않아요. (1)목표 유전자의 RNA-Seq read enrichment(2)엑손 포획(3)Amplicon의 염기를 포함한 다양한 방법이 개발되었습니다. 최근 조사에서 세포 융합을 검출하고 467개의 암 관련 유전자 엑손을 포획했습니다. Amplicon targeting은 전 사물의 5'및 3'말단에서 시발체 디자인을 필요로 하고 세포 융합 현상의 정량 분석을 가능하게 한다. 이 전략은 최근 폐 암 샘플에서 ALK(종양 유전자)융합의 검출에 사용되었습니다. ​ NuGene과 ArcherDX로 두개의 유사한 Amplicon베이스의 방법이 개발·상용화되고 있어 예상되는 융합 현상은 어댑터 서열을 표적으로 하는 공통 프라이머와 함께 2개의 배열 특이적 프라이머에 의해서 검사되었습니다.선택적 이어붙이기 및 유전자 융합합동형체의 복잡성을 푸는 궁극적 해법은 처소음부터 끝까지 각 전사물을 서열화하는 것이다. 이를 위해 두 가지 전략이 수립되었습니다. PacBio의 염기 플랫폼의 Single-molecule real time sequencing(SMRT)은 최대 5 kb의 오랜 read를 공급한다. 그러면 이 방법은 비용이 많이 들고 오류가 많아서 다중화하기가 어려워집니다. SMRT 데이터를 짧은 잘 RNA-Seq 판독과 결합한 하이브리드 시퀀싱 방법이 도입되었습니다.두 번째 방법인 Synthetic long-read-RNA sequencing(SLR-RNA-seq)은 Ilumina MOLECULO 시스템을 기반으로 한다. SLR RNA-Seq를 사용하면 RNA의 기질을 1 well당 1000개 이하의 전사물로 희석하므로 재발도 한 유전자의 두 전사물이 재발도 했다 well에 있을 확률이 데당이 낮아요. 이와 같이, 각 웰에서 유전자를 판독하는 것은, 유전자의 단 하나, 전사물의 전장을 커버하도록 조립됩니다. Illumina MOLECULO 플랫폼에서 단편화, 바코드작성, 라이브러리 prepration, 시퀀싱을 실행한 후 pool에 있는 원전사물의 구조를 직접 보여줄 수 있습니다. PacBio 시퀀싱과 비교하여 SLR-RNA-Seq는 더 긴 전사물과 더 많은 수의 검출된 동형체를 검출하는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 방법은 특히 선택적 연결(AS) 및 비정상 융합형체 분석에 유용하다.Targeted RNA-seq 특정 유전자 그룹이 관심 대상인 경우 특정 전사물만 선택하여 시퀀싱 할 때도 있습니다. 전전사체 시퀀싱을 사용하여 쉽게 분석할 수 없는 발현량이 적은 유전자는 역시 targeted RNA-seq를 사용하여 검출할 수 있습니다. 두 가지에 한 가지 반적인 접근, 즉 target capture 및amplicon sequencing이 사용되었습니다. target capture법은 cDNA또는 RNA에 결합한 바이오틴이 너무 화가 나지 않아 된 probe set을 사용하여 특정 유전자를 선택하는 것을 포함(그림 2). 거꾸로 amplicon의 염기는 cDNA표적의 증폭으로 유전자 특이적 프라이머를 사용한다(그림 3). 어프로치는 template switching에 의한 cDNA 합성 후의 두 개의 특이 프라이머, 하자의 특이 프라이머 및 하자의 공통 프라이머를 갖는 nested PCR 및 poly(A)미 프라이밍을 위한 프라이머와 조합된 specific targeting primer를 포함한 amplicon 디자인으로 다르다.최근 whole exome 조사에서 target capture 방법은 amplicon 기반의 접근법보다 더 복잡하고 균등성을 공급함으로써 자신감을 갖게 되었습니다. 그러기 위해서는, 타겟의 캡터 방법은 보다 많은 비용이 듭니다. 따라서 복잡한 분석을 포함하지 않는 조사의 경우 T세포 및 B세포 수용체 레퍼토리의 분석에 의해 예시되듯이 amplicon 베이스의 방법이 요망된다.​

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Single-Cell RNA-Seq Single cell에서 유전자 발현을 이해하는 것은 세포내 유전자 조절의 전체적인 그림을 보는 데 중요할 것입니다. 하지만 single-cell analysis에는 문재점이 있는데 single cell의 분리, 매우 소량의 RNA에서 cDNA libraries를 준비하기 위한 sensitive한 method, single-celllanalysis를 위한 맞춤 계산비결 등입니다.​ 포유 동물에서 하나의 cell은 약 5~15pg의 RNA을 가지고 있는 반면 기존 RNA seq의 비결은 1반 적으로 1ng미만의 RNA의 염기에 맞지 않습니다. 그러므로 single cell의 RNA seq의 경우 RNA/DNA amplification도 sample processing효율을 향상시킬 필요가 있습니다. ​ CEL-Seq and MARS Seq와 같은 1부의 비결은 RT사이 oligo dT를 포함한 T7 promoter순서를 도입했지만, 이는 in vitro transcription에 의해서 RNA의 linear amplification을 가능하게 하는 것입니다.

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Small RNA이 프로토콜은 5'포스페이트와 3'히도우록의 실기를 포함한 모든 RNA에 대한 어댑터의 결합을 이용하고 computationally(계산.)뒤에 small RNA가 선택합니다. 프로토콜에 사용된 어댑터는 single-stranded RNA에 특이적이어서 특정 oligonucleotide를 사용하여 어댑터가 5.8S rRNA에 연결하는 것을 방지할 수 슴니다. RT는 small RNA의 3'말단에 연결된 서열에서부터 시작합니다. 잉덱싱 된 프라이머는 바코드 시퀀스와 동 1 한 용도로 사용뎁니다.약 8년 동안 모두타 RNA-Seq는 유전자 발현을 연구하고 RNA의 생합성 및 대사 양상을 조사하기 위해 널리 사용되는 필수적 접근이 되었습니다. 시퀀싱 기술의 진보에 따라 많은 비결이 개발되어 새로운 RNA-Seq의 비결이 미래에 등장할 것으로 예상됩니다.다양한 분야에서 RNA 분석과 특히 관련이 있다고 소견하고 있습니다. 둘째, 현재 시퀀싱 플랫폼에는 사이즈 제한이 있습니다. 때때로 판독을 처리하고 높은 판독 출력을 제공할 수 있는 instruments는 alternative initiation(AS), alternative polyadenylation, gene fusions에 의해 발발한 것도 포함해 transcriptis ofms의 정량 분석에 특히 유익할 것이다. 둘째, 현재의 염기서열 분석으로는 homopolymers가 잘 처리되지 않습니다. 이것은 특히 transcript metabolism에서 중요한 역할을 하는 poly-A 꼬리부위의 서열결정과 관련이 있습니다. 셋째, amplification을 줄이거나 없애기 위해 시퀀싱의 민감성을 더욱 향상시킬 필요가 있습니다. 이는 single cell 분석에서 중요하며 현재는 소수의 유전자만 검사할 수 있습니다. 마지막으로 세포에서의 RNA 발현 spatial information 조사는 RNA-Seq 의 새로운 영역이다. #RNA-seq #Transcriptome 출처: 이 글은 필명 라이언, ○○, S.Oh 님에게 정리해 주신 것이다.